SECUENCIACIÓN CAPILAR

La secuenciación de ADN por tecnología capilar se realiza utilizando el método del dideoxi-terminal, desarrollado por Frederick Sanger, este método se basa en la capacidad de la DNApolimerasa para generar cadenas de diferentes tamaños de ADN complementario a una cadena patrón, esto debido a que en la mezcla de reacción son incluidos los 4 dideoxinucleotidos marcados con fluorescencia diferencial, que al ser incorporados a la cadena en crecimiento detienen la polimerización.

Utilizando la técnica de Sanger en sistemas automatizados de tecnología capilar y de fluorescencia, se puede detectar de manera diferencial cada uno de los dideoxinucleótidos que se adicionan al final de una fragmento en polimerización que es separado, de otros fragmentos de diferente tamaño, por medio de una electroforesis capilar y por medio de un software, se descifra la secuencia de un fragmento de ADN.

La secuenciación se realiza utilizando la química BigDye Terminator v3.1 y electroforesis en sistema multicapialr automático.

LABSERGEN ofrece a todo el sector académico, industrial y publico el servicio de secuenciación de ADN. Para ello cuenta con el equipo AB3730 que emplea la técnica de Sanger y tecnología capilar.

Información del Servicio

Secuenciación de productos de PCR, plásmidos, ADN cadena sencilla, BACs, etc. Las secuencias se obtienen utilizando los primers del usuario o primers estándar.
Se generan lecturas de aproximadamente 800 nucleótidos. La longitud de la secuencia que se obtenga depende de la calidad, integridad y concentración de la muestra. Por lo que teniendo una buena muestra podrán obtenerse más lecturas.
La secuenciación por Sanger permite procesar desde una muestra en formato individual hasta 96-384 muestras en formato de placa.
Visualización, edición y valoración de la calidad de los resultados, que serán enviados vía correo electrónico.
Resultados en un máximo de 7 días desde la recepción de la muestra.
Se deberá entregar junto con la muestra, el FORMATO DE SOLICITUD DEL SERVICIO.

Requerimientos de la Muestra

>MUESTRAS FORMATO INDIVIDUALMUESTRAS FORMATO EN PLACA

Plásmidos de cadena doble	400ng x reacción (Concentración >= 25ng/µl)
DNA cadena sencilla	200ng x reacción (Concentración >= 25ng/µl)
Productos de PCR sin clonar	200ng x reacción (Concentración >= 25ng/µl)
BACs	Dependiendo del tamaño del BAC.
Formato en placa	Concentración homogénea de acuerdo al tipo de material a secuenciar.

El ADN debe estar libre de ARN, fenol, sales, etanol, EDTA, proteínas, detergentes.
En el caso de secuenciación directa de productos de PCR, éstos deben estar libres de subproductos, primer excedentes, dNTPs y sales.
El ADN puede estar liofilizado o resuspendido en agua.
Indicar en el formato de solicitud de secuenciación el tipo de vector, tamaño del inserto y concentración de la muestra. El nombre (muestra y primer) debe ser menor a 8 caracteres y que coincida con el etiquetado del tubo.
Las muestras que se reciban a una concentración menor a la mínima solicitada no serán viables de ser procesadas.

El ADN debe estar libre de ARN, fenol, sales, etanol, EDTA, proteínas, detergentes, etc. En el caso de secuenciación directa de productos de PCR, éstos deben estar libres de subproductos, primer excedentes, dNTPs y sales.
El ADN puede estar liofilizado o resuspendido en agua.
La concentración debe ser homogénea en toda la placa de acuerdo al tipo de muestra, ya que en este caso no se cuantifican.
Las placas deben estar perfectamente selladas con tapete adhesivo impermeable, para evitar contaminación cruzada.
Indicar en el formato de solicitud de secuenciación el tipo de vector, tamaño del inserto, concentración y tipo de la muestra. El nombre de la placa debe ser menor a 8 caracteres y que coincida con el etiquetado en la placa.

Para ambos casos se sugiere que la cuantificación se realice por espectrometría o fluorometria, con la idea de lograr una medición lo más exacta posible, esto para evitar reacciones fallidas que también serán cobradas, Una manera de asegurar la integridad de la muestra es verificar que la relación O.D. 260/280nm este en un rango de 1.7-2.0 y la relación Abs 260/230 este en 2.0.
La muestra a mayor limpieza, generara una mayor cantidad de bases secuenciadas, para los productos de PCR es muy importante asegurar que la banda de amplificación sea única, el producto debe estar purificado por columna (que no contenga fibra de vidrio) para eliminar los primer y nucleótidos excedentes de la reacción

Primers

Los primer deben estar resuspendidos en agua.
La secuenciación se puede realizar con primer específicos del gen o con primer estándar.
Es recomendable enviar directamente del Stock un volumen de al menos 5µL por cada muestra que se quiera secuenciar.
El servicio dispone de los iniciadores universales para vectores tales como M13FW, M13Rev, T3, T7 y SP6, los cuales ya están incluidos en el costo del servicio. Si requieren otro primer diferente a estos el usuario deberá proporcionarlos.

Envío de Muestras

Las muestras deben enviarse con las condiciones antes mencionadas. Muestra individuales cualquier tipo de tubo, debidamente etiquetados (coincidiendo con el nombre en el formato), y perfectamente sellados, para evitar que en el envió se abran. En caso de formato en placa puede ser en cualquier tipo de placa, sellada con un tapete impermeable para evitar contaminación cruzada.
Las muestras (tubos o placas), junto con el formato de solicitud de servicio se enviarán por correo ordinario o mensajería a temperatura ambiente (a decisión del usuario) o se entregarán directamente en LABSERGEN (Laboratorio de Servicios Genómicos).

Para el envío de muestras y/o primers sugerimos no enviar volúmenes menores a los 5µl porque se puede evaporar y perder la muestra

Laboratorio de Servicios Genómicos Langebio-Cinvestav
K.m 9.6 libramiento norte carretera Irapuato-León
C.P. 36821-36824*
Colonia: El copal, Malvas o El copalillo*
Irapuato, Gto. México
Con atención: Clara Gutiérrez
*Dependiendo de la paquetería que escoja el usuario.

Entrega de Resultados

El plazo máximo de entrega de resultados es de 7 días desde la fecha de recepción.
Los resultados serán enviados vía correo electrónico, archivos de texto Fasta y archivos gráficos del electroferograma. Los electroferogramas serán enviados en formato. ab1, para poder ser analizados en cualquier sistema operativo (MAC, PC, Linux...) por medio de softwares gratuitos disponibles en la WEB y compatibles al sistema operativo que utilice el usuario.

Chromas http://technelysium.com.au/wp/chromas/

FinchTV https://www.macupdate.com/app/mac/16813/finchtv
Si el usuario solicita edición, se enviaran los archivos originales y editados. Edición: Implica el rasurado del vector de clonación y solución de posibles indeterminaciones, verificación de las bases y sus calidades eliminando de la secuencia la calidad menor a 20 de los extremos. Ensamble de dos o más secuencias generadas del mismo fragmento de ADN donde se haya utilizado primers para la lectura de los extremos o entre secuencias generadas de diferentes fragmentos de ADN. El ensamble solo se puede realizar editando las secuencias.
Para formato de placa no se ofrece el servicio de edición.