PCR TIEMPO REAL

La PCR cuantitativa es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y cuantificar simultáneamente de forma absoluta el producto de la amplificación (segmentos de ADN, comúnmente llamado amplicón). La medición es por ciclo, por lo que se le denomina PCR en tiempo real. La PCR cuantitativa (qPCR) se hace posible gracias a que el amplicón es marcado con un fluoróforo que tras ser excitado a cierta longitud de onda es detectado por los sensores del termociclador, lo que permite cuantificar la fluorescencia emitida.

Información del Servicio

Estrategias de cuantificación:

Cuantificación Absoluta: Determina el número exacto de moléculas de ADN (qPCR) ó ARN (qRT-PCR) presentes en una muestra determinada.
Cuantificación Relativa: No es necesario saber la cantidad precisa de la secuencia de interés, para poder hacer su cuantificación.

Especificaciones del Servicio

Generación del cDNA.
Prueba de oligos.
Generación de la curva estandar por gen a evaluar.
Reacciones de PCR Tiempo Real.
Análisis de la expresión diferencial.

Requerimientos de la Muestra

Se requieren al menos de 30-40ug de ARN total para cada una de las condiciones a evaluar.
Las muestras de ARN deberán entregarse liofilizadas o en agua.
El cliente deberá proveer información del cociente D.O. 260/280 y D.O. 230/260, obtenido al momento de la cuantificación de las muestras, este, en ambos casos deberá ser ≥ 2.0.

Recomendaciones para la purificación y extracción del ARN

Se recomienda a los usuarios que la extracción del ARN se lleve a cabo mediante Fenol ácido, y el ARN extraído sea sometido a un paso de purificación posterior haciendo uso de columnas de sílica gel.

El laboratorio de Servicios Genómicos también cuenta con el servicio de extracción de RNA.

Cuantificación

Se sugiere que la cuantificación sea realizada por espectrometría o fluorometría, con la idea de lograr una medición lo más exacta posible. El cliente deberá proveer información del cociente D.O. 260/280 y D.O. 230/260, obtenido al momento de la cuantificación de las muestras, este, en ambos casos deberá ser ≥ 2.0.

Requerimientos para los OligoNucleótidos (iniciadores)

El grado de pureza recomendado para los mismos es HPLC, sin embargo, en la mayoría de los casos, oligonucleótidos únicamente desalados pueden emplearse sin problema alguno. Junto con las muestras y los oligonucleótidos, se debe entregar el formato de solicitud de servicio.

Envío de Muestras

Las muestras deben enviarse con las condiciones antes mencionadas. Muestra individuales cualquier tipo de tubo, debidamente etiquetados (coincidiendo con el nombre en el formato), y perfectamente sellados, para evitar que en el envió se abran.

Entrega de Resultados

Los resultados generados serán enviados al cliente a través de correo electrónico en un archivo Excel, los datos entregados incluyen:

Las imágenes correspondientes a la curva de disociación y la Tm para cada uno de los amplicones.
Los rangos dinámico establecidos que garantizan la eficiencia de la reacción de PCR.
En análisis de expresión diferencial relativo al tratamiento seleccionado como calibrador.